Lasers ultrarapides pour la microscopie multiphotonique

Les lasers femtoseconde offrent de nombreuses possibilités, influençant les progrès dans les domaines scientifique, médical et industriel. Actuellement, une large gamme de produits laser ultrarapides est disponible, émettant à différentes longueurs d'onde dans les domaines du proche infrarouge et du visible. Ces dernières années, on a assisté à l'émergence notable de plusieurs alternatives aux lasers ultrarapides vieillissants, complexes, coûteux et souvent peu fiables des acteurs établis. Dans cette note d'application, nous expliquons comment choisir une source laser qui réponde au mieux aux besoins et aux exigences des applications de microscopie multiphotonique.

Microscopie multiphotonique

La microscopie multiphotonique (MPM) est une technique d'imagerie puissante largement utilisée dans la recherche biologique et biomédicale. Contrairement à la microscopie à fluorescence traditionnelle, qui utilise l'excitation d'un seul photon, la MPM utilise plusieurs photons pour exciter une molécule fluorescente. Cette approche offre plusieurs avantages, notamment une pénétration plus profonde des tissus, une réduction du photodommage et une meilleure résolution spatiale. Bien que la microscopie à trois photons présente de nombreux avantages, la microscopie à deux photons est actuellement plus populaire car les sources laser appropriées sont plus facilement disponibles dans la gamme de longueurs d'onde souhaitée. Pour la microscopie à deux ou trois photons, des densités de photons élevées sont cruciales pour obtenir une excitation suffisante du fluorophore.

Les densités de photons doivent être supérieures de plusieurs ordres de grandeur à celles requises pour la microscopie confocale ou à photon unique. Pour atteindre de telles densités de photons, des sources laser fournissant une puissance crête très élevée dans le régime ultrarapide sont nécessaires.

Sources laser pour la MPM

L'un des plus grands défis pour l'adoption généralisée de la microscopie multiphotonique est de trouver une source de lumière appropriée pour une excitation efficace des fluorophores. Pour atteindre la puissance crête élevée nécessaire aux processus optiques non linéaires, on utilise des lasers à verrouillage de mode femtoseconde. Ces lasers ( lasers ultrarapides ) peuvent fournir des puissances de pointe très élevées pendant des durées d'impulsion très courtes tout en maintenant une puissance moyenne faible pour éviter d'endommager l'échantillon. Jusqu'à récemment, les meilleurs lasers pour la microscopie à deux photons étaient des lasers accordables à saphir de titane (Ti:Sa). Bien que les lasers Ti:Sa modernes offrent une qualité et une stabilité de faisceau excellentes, ils sont extrêmement coûteux pour de nombreux laboratoires. Ils occupent beaucoup d'espace sur la table et au sol, et nécessitent une maintenance régulière de leurs systèmes de refroidissement liquide, qui produisent un bruit perceptible.

Ces dernières années, cette situation a incité les fabricants de lasers à introduire des lasers à fibre et à semi-conducteurs refroidis à l'air pour la microscopie à deux photons, qui sont moins coûteux et beaucoup plus compacts. Contrairement aux lasers Ti:Sa, ces nouveaux dispositifs émettent des impulsions à une seule longueur d'onde fixe et sont récemment devenus disponibles dans la gamme hautement souhaitable des 900 nm et 1000 nm avec des durées d'impulsion inférieures à 150 fs. 

Dans la section suivante, nous passerons en revue les paramètres importants à prendre en compte lors de la sélection d'un laser ultrarapide pour la microscopie multiphotonique.

Choix d'un laser fs pour la MPM

Pour sélectionner le laser approprié, il faut tenir compte de l'interaction entre la puissance moyenne, la puissance crête, la durée de l'impulsion, le taux de répétition du laser et la qualité de l'impulsion. Ces paramètres peuvent prêter à confusion, c'est pourquoi nous allons passer en revue les plus importants d'entre eux et la manière dont ils interagissent.

Puissance moyenne et puissance crête

Il est communément admis que l'intensité de fluorescence générée à partir d'un échantillon par un processus à deux photons est proportionnelle au carré de la puissance du laser. Bien que cela soit exact, l'intensité réelle de la fluorescence est proportionnelle au carré de la puissance crête du laser (_Ppk), du taux de répétition du laser (R) et de la durée de l'impulsion du laser (τ) :

La figure 1 ci-dessous compare la fluorescence générée par deux lasers ayant la même durée d'impulsion et la même puissance moyenne. L'un des lasers a un taux de répétition de 40 MHz, tandis que l'autre a un taux de répétition de 80 MHz. Le nouveau laser fs VINCI-1064 de l'indie, dont le taux de répétition est deux fois plus faible, aura donc une puissance crête deux fois supérieure à celle d'un laser à 80 MHz. Cette puissance crête plus élevée permettra de multiplier par deux l'intensité de la fluorescence, conformément à l'équation 1 ci-dessus.

Puissance crête élevée est nécessaire dans le processus d'excitation multiphotonique, dans lequel deux photons ou plus sont absorbés simultanément par un fluorophore, ce qui entraîne l'émission d'une lumière à une longueur d'onde plus courte que la lumière d'excitation. Si une puissance crête élevée est nécessaire, il est crucial de maintenir la puissance moyenne à un niveau acceptable afin d'éviter les dommages causés à l'échantillon par les photons. Il est donc essentiel d'équilibrer correctement la puissance crête, la puissance moyenne et le taux de répétition.

Durée de l'impulsion

Les lasers femtoseconde ont généralement des durées d'impulsion comprises entre 80 et 200 femtosecondes. Comme indiqué ci-dessus, à puissance moyenne égale, des impulsions plus courtes conduisent à une puissance crête plus élevée, ce qui augmente l'efficacité de la fluorescence. VINCI-1064 se caractérise par une durée d'impulsion inférieure à 60 femtosecondes (typiquement 50 fs) avec une puissance crête proche de 1 MW, idéale pour une excitation efficace des fluorophores.  

Mais bien que des durées d'impulsion plus courtes soient avantageuses pour améliorer l'intensité de la fluorescence, il devient essentiel de compenser correctement la dispersion chromatique de l'optique du microscope afin d'éviter l'élargissement de l'impulsion au niveau de l'échantillon. C'est pourquoi VINCI-1064 dispose d'une pré-compensation de dispersion accordable de haute précision jusqu'à 25 000 ^fs2.

Spectre d'émission

La microscopie à deux photons à une longueur d'onde de 1064 nm permet d'exciter des protéines fluorescentes rouges. La figure 2 ci-dessous montre la section transversale d'absorption à deux photons de quelques-uns de ces fluorophores superposée au spectre d'émission de VINCI-1064. Comme on peut le voir, le spectre d'émission de VINCI-1064 correspond bien au spectre d'absorption à deux photons de la plupart des protéines fluorescentes rouges courantes.

Coût

Malgré leur coût réduit, les lasers à longueur d'onde unique lancés ces dernières années restent chers par rapport aux lasers accordables. Ce coût élevé est inhérent à l'architecture laser complexe couramment utilisée dans ces lasers à fibre compacts et ultrarapides. Les lasers à fibre femtoseconde de la série VINCI sont basés sur une architecture optique ultra-simple et représentent une solution très rentable pour la microscopie à deux photons. Le coût de VINCI se compare souvent favorablement au coût typique de réparation d'un laser d'un acteur établi.

Un résumé des performances des lasers par type de laser est présenté dans le tableau 1 ci-dessous.

Résultats expérimentaux

VINCI-1064 a été installé sur un microscope à deux photons, comme illustré à la figure 3. La figure 4 illustre des neurones hippocampiques de rats cultivés exprimant la protéine fluorescente mCherry et l'indicateur d'ions chlorure MQAE (bleu), imagés avec le laser indie à 1064nm sur le microscope à 2 photons.

Comme le montre la figure 4, VINCI-1064 permet une imagerie de haute qualité des neurones hippocampiques avec un rapport signal/bruit élevé.

Conclusion

La microscopie multiphotonique (MPM) est une technique d'imagerie puissante largement utilisée dans la recherche biologique et biomédicale. Pour atteindre la puissance crête élevée nécessaire, des lasers femtosecondes à verrouillage de mode sont requis. Pour choisir le meilleur Laser femtoseconde, il est important de prendre en compte des facteurs tels que la puissance moyenne, la puissance crête, la durée de l'impulsion, le taux de répétition du laser et la qualité de l'impulsion. La nouvelle série VINCI de lasers à fibre femtoseconde d'indie se caractérise par des puissances crête très élevées et est basée sur une architecture optique ultra-simple qui en fait la solution la plus rentable pour la microscopie à deux photons.

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^{*Avec l'aimable autorisation du Centre de recherche CERVO, Québec, Canada}

Article de Blogue

Amélioration de la microscopie à deux photons avec le laser fs VINCI-1064

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